近幾年，隨著非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）在國內(nèi)依次暴發(fā)，可以滿足人們快速而精準(zhǔn)檢測需求的real-time PCR方法成為病原檢測的主流。而核酸提取作為保障病毒核酸檢測結(jié)果精準(zhǔn)的重要環(huán)節(jié)也備受重視。2020年初，核酸提取市場需求火熱，市面上甚至出現(xiàn)了核酸提取儀一機(jī)難求的局面。巨量的核酸提取市場需求極大刺激各大IVD研發(fā)企業(yè)爭相推出相關(guān)產(chǎn)品。僅僅一年的時間，在2021年的杭州獸醫(yī)檢測診斷大會上出現(xiàn)了家家展位有核酸提取的盛況。如何在這些眼花繚亂的產(chǎn)品中，選出適合我們自身需求的那一款對我們來說也是一種極大的考驗(yàn)。

一、提取試劑盒的類型

雖然市面上病毒核酸提取試劑盒的產(chǎn)品非常多，但按照提取類型和提取方式不同大概可以分為以下幾類：

1. 提取類型

主要可以分為DNA提取、RNA提取和DNA/RNA共提取。DNA提取和RNA提取的主要區(qū)別在于：DNA易溶于高鹽、高pH，而RNA易溶于低鹽、低pH，且RNA提取還需要抑制RNase的活性。DNA/RNA共提取則需要調(diào)整一個既適合于DNA也適合于RNA的鹽濃度和pH，且抑制RNase的活性，如何將兩個需求矛盾的產(chǎn)品良好的融合在一起，也對各企業(yè)提出了更高的技術(shù)要求。

2. 提取方式

從提取方式劃分，主要可分為機(jī)提和手提。目前市面上的機(jī)提主要是磁珠法的自動化提取，其具有自動化程度高、操作簡便、提取通量高等特點(diǎn)。手提可分為磁珠法手提和柱式法手提，適用于樣本量較少的情況。匯總比較如表1所示。

二、提取試劑盒該如何選擇？

在牧場條件下，病原種類較多，需檢測的樣本類型也是復(fù)雜多樣，對核酸提取試劑的適應(yīng)性就有了更高的要求。我們可以結(jié)合日常檢測的需求，選擇一款滿足自身牧場需要的產(chǎn)品類型。

(1) 同時滿足DNA/RNA提取

豬病毒類型多樣，如果選擇DNA或RNA單提取試劑盒，需要采購兩種不同的試劑盒，采購需求就會比較混亂，而且稍不注意就會混用，導(dǎo)致檢測提取的失敗，這種情況也是經(jīng)常發(fā)生，所以一款能同時滿足DNA/RNA共提取的產(chǎn)品就可以避免出現(xiàn)這種情況。

(2) 操作簡便快捷、高通量

全自動磁珠法核酸提取在幾種提取方式中是最為簡單的，可以減少人工操作，減少人為誤差，并且可以高通量提取，適應(yīng)于中大型豬企每天做大量樣本檢測，但是全自動提取設(shè)備的價(jià)格較貴。對于每天只有少量樣本檢測需求的企業(yè)來說，磁珠手提法可以作為一個優(yōu)選，它相對柱式手提法操作更為簡便，對設(shè)備要求相對更低。

(3) 提取時間短

有些時候，豬場對于檢測結(jié)果需求較為迫切，那么提取時間也是越短越好，以前提取產(chǎn)品時間大多數(shù)在半個小時以上，目前大部分機(jī)提法產(chǎn)品可以實(shí)現(xiàn)提取時間≤15min，這類產(chǎn)品提取時間短，同時也能保證提取效率。手提磁珠法相對柱式法，減少操作步驟，簡化操作方式，提取時間更短。

(4) 提取效率是根本

對于不同的病毒類型（DNA或者RNA病毒）、不同的病毒濃度（強(qiáng)陽、中陽、弱陽）、不同的樣本類型（血液、組織、環(huán)境、飼料等），都應(yīng)保證提取試劑盒具有較高的提取效率，這也是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保障。

(5) 樣本適應(yīng)性強(qiáng)

不同的病原體具有不同的組織嗜性，且排毒方式和載量也各不相同，在疫病診斷過程中，樣本類型的差別較大，并且在生物安全防控過程中檢測的樣本范圍也不再僅僅局限于宿主本身，這就導(dǎo)致了在豬場疫病檢測和監(jiān)測過程中，遇到的樣本類型會更加復(fù)雜。對于磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒而言，裂解液的優(yōu)化、磁珠的選擇以及兩者之間的搭配，是決定其是否具有良好的樣本適用性的關(guān)鍵因素。

三、日常遇到的小問題

由于核酸提取技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用，在日常檢測中也遇到了很多有趣的問題，今天小編也選取了幾個常見的問題，跟大家簡單聊一聊。

問題一、當(dāng)前用量最大的新冠專用提取試劑盒和非瘟用提取試劑盒有什么區(qū)別？

(1) 提取病毒類型和大小的不同。SARS-CoV-2屬于RNA病毒，基因組大小約為30kb；ASFV屬于DNA病毒，基因組大小為170~193kb；兩者提取的技術(shù)難度有很大區(qū)別。

(2) 樣本類型的差異。SARS-CoV-2的樣本主要是咽拭子、鼻拭子和環(huán)境樣本，樣本類型相對單一；ASFV的樣本包括全血、血清、血漿、唾液、精液、鼻咽拭子、環(huán)境、組織、糞便、飼料等，樣本類型紛繁復(fù)雜。

當(dāng)前牧場用提取試劑盒雖然有廣泛的適應(yīng)性，但難免也會碰到很多問題，小編將ASFV提取中經(jīng)常遇到的樣本適用性差的現(xiàn)象和原因總結(jié)如下，可供大家參考：

問題二、不加蛋白酶K，會影響病毒DNA/RNA的提取效率嗎？

在核酸提取中，蛋白酶K的主要作用是：消化蛋白，尤其是消化核酸-蛋白復(fù)合體中的蛋白，從而使核酸釋放。真核生物細(xì)胞核中的核酸大部分是以染色體的形式存在，在提取真核生物DNA時，如果不加蛋白酶K，提取總量會大大降低。而病毒的結(jié)構(gòu)相對比較簡單，主要由蛋白外殼和擬核組成，無染色體結(jié)構(gòu)，且核酸含量相對較少。所以，對于病毒DNA/RNA，通過優(yōu)化提取試劑盒的裂解細(xì)胞、變性蛋白以及去除雜質(zhì)的能力，完全可以做到不使用蛋白酶K，也能保證較高的提取效率。

問題三、樣本量越多，提取得到的核酸豈不是越多？

樣本量增加，如果相應(yīng)的裂解液、結(jié)合液以及吸附核酸的介質(zhì)液相應(yīng)增加，提取到的核酸也會相應(yīng)增多。但對于磁珠法預(yù)分裝試劑而言，增加樣本量，相應(yīng)的裂解結(jié)合液、磁珠沒有增加，即相應(yīng)的裂解、結(jié)合能力沒有提高，提取到的核酸有可能不會增加反而減少，而且增加樣本量會使2.2mL深孔板內(nèi)總體積增加，提取時存在溶液溢出造成混樣的風(fēng)險(xiǎn)。對于柱式法而言，如果只是增加樣本量，提取效果也可能會適得其反。

問題四、核酸提取效率如何評價(jià)？

(1) 用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來測定核酸提取試劑盒的提取靈敏度；

(2) 與市面上認(rèn)可度較高的提取試劑盒對比提取真實(shí)的病毒樣本，分別提取不同樣本類型的強(qiáng)陽、中陽、弱陽樣本，比較兩者的Ct值。

我們通過測評市面上很多提取產(chǎn)品過程中發(fā)現(xiàn)，核酸提取試劑盒的質(zhì)量差異較大，差異不單單是體現(xiàn)在提取的效率，還有樣本的適應(yīng)性上面。這就要求我們自身要提高檢驗(yàn)產(chǎn)品質(zhì)量的能力，從而選出一款真正適應(yīng)牧場檢測需求的產(chǎn)品。